A investigação pré-clínica do fenótipo do câncer, agressividade e resistência aos antineoplásicos é geralmente realizada em modelos in vitro de cultura de células tumorais em duas dimensões (2D ou monocamada). Porém, esse modelo apresenta limitações, como baixa interação celular com a matriz extracelular e entre células de diferentes linhagens. Também existem relatos que o efeito de algumas concentrações dos antineoplásicos não apresentam equivalência in vivo dos valores encontrados na cultura 2D. Assim, os modelos de cultura 3D foram desenvolvidos para promover melhor simulação das condições in vivo de interações celulares e expressões fenotípicas, possibilitando que as células migrem para todas as direções, permitindo um aumento da superfície celular. Diante desses fatores o modelo de cultivo em 3D in vitro é o que mais se aproxima dos modelos in vivo. Os objetivos deste estudo foram desenvolver um modelo de cultura 3D (esferoides) para a linhagem celular de carcinoma de pulmão de não-pequenas células (CPNPC) NCI-H460 e avaliar o efeito da cisplatina neste modelo. Primeiramente foram realizados testes para determinar a densidade inicial de células a serem utilizadas; após foi monitorado o tempo de crescimento dos esferoides e padronizado o protocolo. As células foram plaqueadas em ágar + meio de cultura completo e após o crescimento, os esferoides foram coletados, tratados com concentrações de 0-10 µg/mL de cisplatina. A análise foi realizada por mensuração do diâmetro dos esferoides antes do tratamento, 48 h após o tratamento e depois a cada 3 dias, até os esferoides se desintegrarem. Observou-se que: 1) a densidade ideal a ser utilizada para este experimento nessa linhagem celular é 10x10⁴ células, 2) o tempo para a formação dos esferoides nessa linhagem é de 7 dias; 3) que as condições para o cultivo envolvem uma diluição de 1:5 de ágar em meio de cultura completo; 4) a durabilidade dos esferoides desta linhagem é cerca de 20 dias após coletados; 5) os esferoides não tratados apresentaram um aumento significativo de diâmetro em relação aos tratados com cisplatina. Com isso, concluímos que o método de formação de esferoides proposto por esse trabalho permite o uso de linhagens de CPNPC NCI-H460 como modelo de cultura 3D para estudos in vitro a fim de contribuir para conhecimentos mais profundos em relação a pato-biologia do tumor e eficácia de fármacos antineoplásicos e que a cisplatina apresenta efeito inibitório neste modelo 3D.