Os principais impactos ambientais provenientes de malhas ferroviárias não diferem significativamente dos gerados por estradas. A mortalidade de vertebrados terrestres decorrente de colisões com trens podem ser expressivas, onde mamíferos e aves são particularmente os grupos mais impactados. Trabalhos inventariando a mastofauna atropelada em ferrovias são inexistentes na América do Sul. O Rio Grande do Sul é detentor da mais densa malha ferroviária do sul do Brasil e futuras ampliações das linhas férreas adicionarão mais de 500 km a malha do Estado. Neste cenário de desenvolvimento, a diversidade de mamíferos torna-se cada vez mais ameaçada por estes empreendimentos e os esforços para conservação devem ser potencializados no sentido de mitigar e reduzir ao máximo os impactos advindos destas atividades. Identificar locais prioritários para redução de atropelamentos é indispensável para maximizar o efeito das medidas mitigatórias. Nesse estudo identificamos a mastofauna atropelada em ferrovias que atravessam seis municípios da região serrana do Rio Grande do Sul, relatamos a abundância relativa, a categoria de ameaça e indicamos os trechos com maiores índices de atropelamento. A coleta de dados se deu entre os anos de 2008 e 2011 mediante realização de transectos não-lineares coincidentes com o traçado da linha férrea. Os percursos foram feitos a pé, totalizando 27 km divididos em seis trechos municipais: Muitos Capões; Bom Jesus; Veranópolis; Bento Gonçalves; Muçum; e Guaporé. Todos os transectos são predominantemente marginais a rios, atravessando três regiões fitoecológicas distintas, Floresta Ombrófila Mista, Floresta Estacional Semidecidual e Estepe de altitude. A topografia da ferrovia foi categorizada em relação ao entorno como “relevo alto”, “nivelado” e “relevo baixo”. Reconhecemos 49 espécimes de mamíferos categorizados em 14 espécies e 11 famílias. Dez espécies foram classificadas como de médio porte e quatro de grande porte, sendo Didelphis albiventris a que apresentou mais registros de atropelamento (n=17), representando 34,69% do total de indivíduos encontrados. Quatro espécies registradas, Eira barbara, Nasua nasua, Cuniculus paca e Tamandua tetradactyla, figuram na categoria de vulnerável e uma,  Tayassu peccari na categoria criticamente em perigo. A taxa de mortalidade de espécies foi de 1,8/km. Todos os registros ocorreram em áreas definidas como “relevo baixo”. Dentro desta categoria, 69,38% dos registros ocorreram em locais onde houve alterações do perfil das encostas.  Dentre estes, cortes de coxilhas e túneis representaram 48% e 6,1% dos registros respectivamente. Este trabalho contribui de forma inédita para o conhecimento do impacto causado na fase de operação de ferrovias sobre a mastofauna terrestre e aponta trechos críticos para travessia deste grupo. Estes resultados, sobretudo indicam locais prioritários para implantação de medidas mitigadoras no sentido de reduzir as taxas de atropelamento de fauna.