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A cinomose canina (CD) é uma doença grave e altamente contagiosa que afeta carnívoros e é freqüentemente fatal. O agente etiológico é o vírus da cinomose canina (CDV, canine distemper virus), gênero Morbillivirus, família Paramyxoviridae. O CDV causa surtos graves em todo o mundo, principalmente em abrigos e unidades de criação. Os cães com cinomose mostram sinais clínicos sistêmicos (gastrointestinais e/ou respiratórios, às vezes com mioclonias generalizadas e localizadas e encefalomielite) dias após a infecção, mas estes achados clínicos são variáveis, dependendo da virulência da estirpe de vírus, as condições ambientais, da idade e imune estado do hospedeiro. (GREENE e APPEL, 2006). O diagnóstico da cinomose ainda é clínico, mas muitos cães não apresentam a forma clássica e/ou podem ser infectados com outros agentes responsáveis ​​pelos mesmos sintomas, tornando o diagnóstico bastante difícil na maioria dos casos (Amude et al, 2007). Este diagnóstico deve portanto ser confirmado por análises laboratoriais com técnicas de isolamento de vírus, análise de anticorpos/antígenos (imunofluorescência e immunocromatografia) e detecção molecular do RNA viral. O objetivo do presente estudo foi o desenvolvimento de um ensaio de detecção molecular com um procedimento de dupla amplificação pela reação em cadeia da polimerase após etapa inicial de transcrição reversa (nested RT-PCR) para a identificação do CDV em diferentes amostras clínicas (sangue, urina e suabes retal e conjuntival). A metodologia consistiu no desenho do ensaio de detecção molecular e validação do teste. Então primeiramente foram selecionados iniciadores (primers) e sondas do gene do nucleocapsídeo de CDV em artigos científicos para estabelecer a etapa de detecção por nested-RT-PCR em tempo real. Também foram analisadas sequências de CDV de diferentes cepas para estabelecimento de uma etapa adicional de diferenciação da cepa vacinal realizando clivagem com enzimas de restrição. A técnica foi então implementada no laboratório, sendo realizados os testes na análise de vacinas e amostras clínicas animais. Os resultados demonstraram que a técnica de nested-RT-PCR em tempo real tem elevada sensibilidade e especificidade, 84,8% e 100,0% respectivamente, quando comparado com o nested-RT-PCR convencional. A análise da amostra vacinal de UI / ml foi diluída 10 vezes (até 1 IU ​​/ ml) e todas as diluições foram submetidas ao procedimento de detecção e quantificação completa (extração de RNA, a RT-PCR e nested verdadeira com  ensaio de PCR em tempo real). Resultados de PCR em tempo real obtidos das diluições foram lineares e reprodutíveis. A elevada correlação (R2> 0,97) foi observada entre as amostras com diferentes cargas virais e do ciclo de leitura correspondente (Ct - limiar de ciclo). A partir destes resultados, verifica-se que a detecção de CDV por PCR em tempo real é efetiva quando comparada com o PCR convencional.