A colibacilose é uma enfermidade relacionada com grandes perdas econômicas na avicultura e é causada pela Escherichia coli extraintestinal denominada genericamente como APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli). O diagnóstico baseado no cultivo bacteriano possui a limitação pelo fato de evidenciar resultados falsos positivos em decorrência da presença de cepas comensais presentes naturalmente no intestino das aves (Avian Fecal E. coli - AFEC). Assim, o diagnóstico confirmatório é baseado na detecção de fatores de virulência (FVs) capazes de diferenciar os patotipos APECs de AFECs. A técnica mais aceita atualmente, utiliza a detecção de cinco fatores de virulência (iroN, iss, iutA, hlyF e ompT) pela técnica de  PCR convencional, onde APECs são identificados pela presença de pelo menos quatro dos cinco destes FVs. O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma técnica molecular de detecção mais rápida, menos subjetiva e menos laboriosa baseado em PCR em tempo real. Para tanto, foram preparados primers e sondas para os mesmos alvos da PCR convencional. Primeiramente APECs sabidamente positivos para os 5 alvos foram testados individualmente, e posteriormente testados na forma de 2 PCRs duplex (iss e iutA; hlyF e ompT) e uma amplificação única para (iroN). Todos os 5 alvos foram eficientemente detectados individualmente, no entanto foi observada perda de sensibilidade analítica nos ensaios em duplex PCR para detecção de iss e iutA. Deste modo, novos primers e condições de amplificação estão sendo testados para detecção destes alvos. Para os 3 alvos restantes (iroN e o duplex hlyF e ompT) foi realizado um ensaio de casuística, comparando-se resultados obtidos por PCR convencional (teste de referência Nolan) com a PCR em tempo real. Foram analisados até o momento 114 isolados de campo (61 APECs e 53 AFECs), e houve total coincidência de resultados na caracterização dos isolados APEC, com sensibilidade, especificidade e concordância. Nos 53 AFECs testados, houve somente um isolado com resultado discordante para o alvo hlyF, ompT e iroN onde a amplificação por PCR convencional foi positiva e a amplificação por PCR em tempo real foi negativa. Até o momento, os primers e sondas que foram desenvolvidos nesse estudo (hlyF,  ompT e iroN) mostraram-se promissores na diferenciação de APECs de AFECs. Para conclusão deste trabalho, espera-se testar os novos alvos iutA e iss, consolidando o ensaio de casuística.