Mycoplasma gallisepticum (MG) é um importante patógeno relacionado com doenças respiratórias em diversas espécies como galinhas, perus, codornas, faisões e pavões. A presença de MG pode levar à diminuição da produção e qualidade de ovos, má eclodibilidade, queda na eficiência alimentar, além de altas taxas de mortalidade e condenação de carcaças. Em galinhas poedeiras é liberado a utilização de vacinas vivas atenuadas, e a diferenciação molecular de cepas vacinais das cepas de campo de MG pode ser útil na detecção de infecções bem como na definição de estratégias de intervenção. Visando desenvolver uma técnica para diferenciação das cepas vacinais, este projeto consistiu na caracterização molecular de cepas de MG em lotes de distintas regiões do país, baseados no sequenciamento de 2 antígenos de superfície (pvpA e mgc2). Primeiramente, preparou-se um banco de genes com amostras de cepas de referência (S6, R, A5969, HF-51 K503, K703 e K730) e cepas vacinais (F, ts-11 e 6/85) para estes alvos. Laboratorialmente foram analisadas a cepa MG70 (cepa vacinal, obtida a partir de galinhas provenientes de plantel assintomático do Brasil) além de amostras clínicas provenientes de 13 lotes comerciais das regiões Centro Oeste, Nordeste, Sul e Sudeste. Realizou-se a extração de DNA (traquéias e swabs traqueais – 3 a 20 amostras por lote) e detecção de MG por PCR em tempo real.  Posteriormente, as amostras MG positivas foram submetidas para amplificação de alvos pvpA e mgc2 e os amplicons sequênciados no equipamento ABI 3130xl. As sequências foram comparadas no programa Mega 5.0 (2000 bootstrap). Os 2 genes analisados neste trabalho confirmaram-se altamente polimórficos com alta capacidade de diferenciação de MG (58 – 100% e 82-100% similaridade respectivamente para o gene pvpA e mgc2).  A cepa vacinal MG70 pode ser diferenciada das cepas de referência, das demais cepas vacinais e também de todas as amostras clínicas avaliadas. Duas amostras de campo da região Nordeste (6032 - Ceará e 1877 -Alagoas) apresentaram 100% de similaridade com a cepa vacinal F, e uma amostra da região Sudeste (1274 – Minas Gerais) apresentou 100% de similaridade com a cepa vacinal ts-11. Além disto, as cepas 2841 e 2834 (ambas da região Sul) apresentaram 100% de similaridade entre si, apesar de serem de lotes distintos. As demais amostras demonstraram-se distintas das cepas de referências e vacinais, confirmando que estes genes de antígenos de superfície são bons alvos para diferenciação de MG.