Portal de Eventos da ULBRA., XIX SALÃO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E TECNOLÓGICA

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Avaliação do duplex PCR em tempo real iss/ iutA na identificação de Escherichia coli patogênica das Aves (APEC)
Vinicius Proença da Silveira, Silvia de Carli, Fernanda Kieling Moreira Lehmann, Vagner Ricardo Lunge, Fabiana de Oliveira Solla Sobral, Nilo Ikuta

Última alteração: 25-10-2013

Resumo


A colibacilose está relacionada com grandes prejuízos na avicultura industrial e a Escherichia coli patogênica das Aves (APEC) é o agente etiológico desta enfermidade. A identificação deste patógeno é dificultada pela presença de cepas comensais na microflora intestinal (AFEC - Avian Fecal Escherichia coli). Atualmente já é conhecido que APECs diferem dos AFECs por carregarem um grande conjunto de fatores de virulência (FV) majoritariamente localizados em plasmídeos. Atualmente a diferenciação destas cepas é baseada na detecção dos FVs plasmidiais iroN, iss, iutA, hlyF e ompT pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de uma metodologia mais prática e rápida para detecção dos mesmos FVs pela PCR em tempo real. Até o momento, obteve-se êxito no acerto dos alvos hlyF, ompT e iroN que apresentaram 100% de concordância de resultados com a PCR convencional (padrão ouro). Observou-se, porém, que a amplificação conjunta dos alvos iutA e iss apresentou uma concordância mais reduzida, devido a resultados falsos positivos gerados pelo iss. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo melhorar a eficiência do teste, através da utilização de 2 novas combinações de iniciadores para detecção de iss testadas conjuntamente com iutA. A primeira combinação de iniciadores consistiu de sequências presentes na região interna do gene iss, e a segunda uma sequência interna ao iss e outra que se localiza numa região adjacente ao gene (sequência plasmidial). Após otimização das reações, foram analisadas 111 amostras de E. coli (61 APECs e 50 AFECs), onde foram realizadas amplificações pela PCR convencional e as 2 novas combinações com a PCR em tempo real. O alvo iutA apresentou os mesmos resultados nas 2 combinações na PCR em tempo real. Quando comparadas com a PCR convencional, obteve-se especificidade (100%), sensibilidade (98,3%), concordância (99,1%) e Kappa de 0,98, indicando estar adequado para a tipificação de APECs. O teste de X2 demonstrou que a comparação da combinação iss 1 com a PCR convencional apresentou diferenças significativas (p <0,05), enquanto a segunda combinação apresentou melhores resultados, sem diferenças significativas. Comparando os resultados das combinações 1 e 2 com o teste padrão, respectivamente verificou-se um aumento de especificidade de 66,7 para 100%, concordância de 84,7 para 99,1% e índice Kappa de 0,68 para 0,98. Verificou-se uma pequena redução na sensibilidade (de 100 para 98,3%), que não alterou a identificação do patotipos estudados. A estratégia da combinação 2, que inclui um iniciador no gene iss e outra na região plasmídial adjacente ao gene foi utilizado também no desenho dos iniciadores deste alvo na PCR convencional. Para tipificação conjunta dos 5 FVs utilizando a nova combinação de iniciadores, verificou-se completa concordância de resultados, demonstrando que a nova técnica é adequada para diferenciação de APECs de AFECs.

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