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O queijo colonial gaúcho é característico do interior do estado do Rio Grande do Sul e sua produção está ligada ao modo tradicional de fabricação, expressando a cultura local e a história das famílias. Iniciativas públicas recentes têm buscado maiores informações deste produto para a efetiva regulamentação dos processos de análise e produção. A fabricação deve seguir normas rigorosas de higiene, com uso de matéria-prima (leite) originária de locais com boas condições higiênico-sanitárias. Entretanto, alguns produtores podem não adotar as boas práticas de fabricação, elevando o risco de contaminação bacteriana do queijo e transmissão ao homem pelo consumo deste alimento. Entre os micro-organismos que são encontrados no queijo, destacam-se os coliformes fecais, Staphylococcus aureus, Salmonella e Listeria monocytogenes. O presente estudo teve como objetivo analisar a ocorrência destes microrganismos em amostras de queijos coloniais provenientes de diferentes fábricas de produção e localizadas em diversas mesorregiões do estado do Rio Grande do Sul. Um total de 177 amostras foram coletadas e submetidas à avaliação microbiológica quantitativa (coliformes e estafilococos) e qualitativa (Listeria e Salmonella). Os resultados demonstraram que 162 (91,5%) amostras apresentaram contagem de coliformes a 35°C com média de 2,3 x 105 UFC g-1 e quinze (8,4%) amostras foram negativas. Na contagem de coliformes a 45°C, 46 amostras (25,9%) apresentaram contagem com média de 1,2 x 105 UFC g-1, quatro com média de 4,4 x 102 UFC g-1 e 123 não tiveram crescimento. Em relação à Staphylococcus coagulase positiva, 78 amostras (44,0%) obtiveram concentração com média de 1,0 x 105 UFC g-1 sendo oito com contagem a 1,0 x 103 UFC g-1 e 92 foram ausentes. Salmonella não foi detectada em nenhuma amostra, mas Listeria foi detectada em 18 amostras (10,1%), sendo que L. monocytogenes foi identificada em três (1,6%) amostras por testes bioquímicos e PCR. Os resultados microbiológicos foram comparados com as variáveis de processo de produção (agroindústrias vs. caseiro), mesorregiões de origem e tempo de maturação, não havendo diferenças estatísticas. Esses dados demonstram a ocorrência de microrganismos patogênicos neste tipo de alimento e enfatizam a importância do estabelecimento de boas práticas na fabricação e realização do controle de qualidade microbiológico do queijo colonial produzido no Rio Grande do Sul.