As salmonelas são bactérias gram negativas, possuem formato de bastão e pertencem ao gênero Salmonella, família Enterobacteriaceae, estas são patogênicas para o homem e animais domésticos. Os isolados destas bactérias são normalmente classificados em sorotipos, conforme combinações de antígenos de superfície somáticos (O) e flagelares (H), estes descritos no documento Kauffmann- White-Le Minor (KWL). A ocorrência dos sorotipos de Salmonella variam entre as localidades, regiões e países, sendo assim a identificação do sorotipo é importante para a compreensão da epidemiologia desta bactéria, tais como disseminação temporal e geográfica e rastreamento de surtos de doenças no homem e em animais. A detecção de Salmonella é realizada pelo isolamento bacteriano e caracterização bioquímica. A identificação de sorotipos necessita de ensaios com reagentes (antissoros) específicos. Metodologias moleculares podem ser utilizadas na detecção de Salmonella e dos sorotipos. O presente trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de sequenciamento de região espaçadora intergênica (operon rrnH) para identificação de sorotipos de Salmonella.Foram obtidos 60 isolados de Salmonella provenientes de culturas bacterianas de alimentos, humanos e aves, coletadas em um período de 2010 – 2016. Todos isolados haviam sido previamente sorotipados pelo Laboratório Central de Saúde Pública do Rio Grande do Sul (LACEN) e por laboratórios privados. Culturas bacterianas dos isolados foram submetidas à extração de DNA pelo método de fervura e após foi realizada a amplificação por PCR em tempo real para o gene invA (presente em todos os sorotipos de Salmonella). As amostras de DNA com resultado positivo foram então amplificadas em uma segunda PCR tendo com alvo a as regiões intergênicas (ISR) do operon rrnH. Os produtos desta PCR foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (para avaliação do tamanho do fragmento amplificado), purificados e quantificados por eletroforese em gel de agarose. Amostras com quantidade suficiente de DNA foram sequenciadas pelo método de Sanger. As sequencias de DNA obtidas foram comparadas com dados de amostras de referências de sorotipos de Salmonella (depositadas no GenBank). Os resultados demonstraram a obtenção de sequências do operon rrnH de 57 isolados de Salmonella com fragmentos entre 550 e 800pb. O sequenciamento demonstrou que isolados estudados apresentaram em torno de 99-100% de identidade com os respectivos sorotipos de referência. Houve elevada concordância (mais de 90%) entre os resultados de detecção tradicional e o sequenciamento do operon rrnH, demonstrando que esta nova forma de análise é uma maneira rápida e eficiente de determinação de sorotipos de Salmonella.