ESTRUTURA E PROPRIEDADES DA QUITOSANA NANOCRISTALINA

Guimarães MF*, Pighinelli L, Reis V, Tedesco MF, Silva MM.

Introdução

Biomateriais são definidos como materiais de origem natural ou feito pelo homem que são usados diretamente como um suplemento e/ou substituinte das funções dos tecidos do corpo humano vivo. Dois parâmetros importantes, que um biomaterial precisa ter são biocompatibilidade e biofuncionalidade [1,2,3]. Os polissacarídeos formam uma classe de materiais que têm sido geralmente subutilizados no campo dos biomateriais. O reconhecimento da utilidade e do potencial desta classe de materiais, porém, é crescente e o campo de biomateriais à base de polissacarídeos, está prestes a experimentar um crescimento rápido. Três fatores contribuíram especificamente para esse crescente reconhecimento dos biomateriais à base de polissacarídeos. O desenvolvimento recente de novas técnicas de síntese, usando oligossacarídeos biologicamente ativos que vão permitir ampliar e explorar novas pesquisas na grande área da engenharia de tecidos, a necessidade associada à criação de novos biomateriais e biocompósitos com propriedades específicas e suas atividade biológicas controláveis e a biodegradabilidade [4]. A quitosana (poli(β-(1,4)-D-glucosamina) e seus derivados são caracterizados por suas excelentes propriedades bioestimulantes que facilitam a reconstrução e a vascularização de tecidos danificados podendo também suprir as deficiências de componentes celulares, condutores da formação de pequenas cicatrizações. As propriedades catiônicas da quitosana, considerada um polieletrólito linear com alta densidade de cargas pode interagir com superfícies negativamente carregadas tais com proteínas e polissacarídeos aniônicos, que é a base de inúmeras aplicações [5,6]. A quitosana e seus derivados são polímeros com excelentes propriedades para serem empregados em medicina regenerativa, pois garantem eficiência em processos de cicatrização. A biocompatibilidade, não-toxidade e atividade antibacteriana são excelentes propriedades para elaboração de novos biomateriais, que por outro lado, mostra um forte apelo de sustentabilidade de recursos, originários da biomassa, ou seja, do descarte da indústria alimentícia que reforçam ainda mais potenciais e a aplicabilidade destes polímeros na área da saúde [15].

Objetivos

Este trabalho tem como principal objetivo, desenvolver um novo método de obtenção da quitosana nanocristalina, avaliar suas propriedades químicas, estruturais e morfológicas visando aproveitar o potencial desta classe de materiais e a importância de se investir no desenvolvimento de uma ciência multi e interdisciplinar com oportunidades translacionais lucrativas na geração de novos produtos ajudando a gestão da saúde pública diversificando mais a gama de novos produtos de baixo custo.

Materiais e Métodos

Quitosana com grau de desacetilação de 95% e teor de umidade de 12,4%, coloração do pó de cor amarelo a creme, densidade 0,31 g/mL, dados fornecidos pela Polymar Ciência e Nutrição S/A (Fortaleza, CE). O ácido acético 99,7 % p.a. (Dinâmica) e o hidróxido de sódio (Sigma-Aldrish). Todos os produtos químicos foram utilizados como recebidos sem qualquer purificação adicional. A quitosana utilizada foi dissolvida com ácido acético e posteriormente foram preparadas quatro soluções contendo 1:0,4; 2:0,8; 3:0,9 e 2:2 de teor de polímero e de ácido acético respectivamente, conforme Tabela 1. A dissolução ocorreu sob agitação por misturador de hélice à temperatura ambiente durante um período de 2 horas a uma rotação 1.000 rpm até a obtenção de uma solução homogênea e transparente. Vinte quatro horas, após a dissolução, cada solução foi filtrada e as amostras formam acondicionadas em recipientes de poliestireno abertos do tipo placa de Petry até a sua secagem a temperatura ambiente. As quatro soluções de partida do acetato de quitosana com aproximadamente 2 litros cada, elaboradas anteriormente, com as seguintes concentrações 1:0,4; 2:0,8; 3:0,9 e 2:2 de teor de polímero e de ácido acético respectivamente, denominadas A – I, B – II, C – III e D – IV, estas soluções ficaram sob agitação constante a uma rotação de 1.000 rpm por um misturador de hélice a uma temperatura ambiente por 30 minutos, em seguida foram adicionadas quantidades de glicerol como agente plastificante: 5 mL; 7,5 mL; 10 mL e 10 mL respectivamente, que são referentes a 0,4 % do teor de polímero. Em seguida foram adicionadas às respectivas soluções, gradualmente uma solução de hidróxido de sódio (NaOH), sob agitação constante, com as respectivas concentrações de acido acético, para obter uma completa neutralização do acido em questão, conforme Tabela 2. Após permanecer, por vinte quatro horas acondicionadas sob refrigeração a temperatura constante de 5 ºC, a solução foi filtrada e lavada com o funil de Büncher, com três litros de água destilada e deionizada para a retirada do sal, acetato de sódio residual que foi formado na reação de neutralização do ácido acético com hidróxido de sódio. As amostras foram acondicionadas em recipientes de poliestireno abertos tipo placa de Petry até a sua secagem a temperatura ambiente. Foram utilizados os seguintes métodos analíticos de caracterização do acetato de quitosana e da quitosana nanocristalina: Espectroscopia de Absorção na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier – (FTIR – ATR): Os espectros de FTIR na região do infravermelho foram registrados em um espectrofotômetro Perkin Elmer, modelo Spectrum One, na região da faixa espectral de 4000 a 650 cm^-1, número de scans 8 e resolução de 4 cm^-1. As medidas foram realizadas em modo de Refletância Total Atenuada. Microscopia Eletrônica de Varredura com Análise Química por Energia Dispersiva (MEV – EDS): A morfologia das amostras de quitosana foi analisada em um microscópio eletrônico de varredura digital – marca JEOL – modelo JSM-6010LA. Para a realização da análise de MEV – EDS uma parte da amostra foi colada no suporte (stub) com uma fita de carbono e estas foram recobertas com uma fina camada de carbono através de evaporação, para torná-las mais condutivas.  Foi selecionada uma região para a avaliação por EDS. As imagens forma obtidas por Detector de Elétrons Secundários (SEI), 15 kV, Sob Alto Vácuo, Distância de Trabalho: 10 mm, Spot Size: 30. Difração de Raios-X (DRX): Os dados de difração de raios-X foram obtidos utilizando o equipamento Rigaku X-RAY Difractometer (DRX). As amostras de quitosana foram analisadas através de medidas de difração de raios-X, com tubo de cobre (λ = 1,54 Å), empregando voltagem de 40kV e corrente de 40mA. As medidas foram realizadas no intervalo 3°<2θ e monocromador de grafite, incidência normal à temperatura ambiente. Os resultados da análise foram obtidos por meio da indexação das fichas cristalográficas. Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (¹H – RMN) Os espectros de ¹H-RMN foram obtidos em um espectrômetro Varian Unity Plus 400 MHz. Com o objetivo de melhorar a resolução dos picos foram estipuladas as seguintes condições: pulso acumulado de 16 varreduras e LB de 0,30 Hz. A largura espectral e os pontos foram de 5000 Hz e 64 K, respectivamente. Os espectros foram calibrados a partir do sinal devido a HOD. Inicialmente, uma solução acidificada 1% (v/v) foi preparada pela adição de 0,05 mL de HCl concentrado a 4,95 mL de D₂O. Cerca de 20 mg de amostra foram adicionadas a 5 mL desta solução e mantida sob agitação constante por 24 horas a temperatura ambiente. O HCl  foi adicionado ao solvente em quantidade suficiente (D₂O/HCl 100:1 v/v) para promover a solubilização de quitosana (imprescindível para a forma neutralizada de quitosana) e no sentido de deslocar os sinais interferentes da região examinada para a determinação de grau de acetilação. Uma alíquota dessa solução viscosa foi colocada em tubos de quartzo de 5 mm de diâmetro. Para diminuir a interferência do sinal do solvente (HDO) com os picos da amostra, o experimento foi conduzido a uma temperatura de 70ºC. Os sinais de RMN e integração dos picos foram atribuídos com auxílio do programa MestReNova. Potencial Zeta e tamanho de partícula: O potencial zeta e o tamanho de partícula das soluções acetato de quitosana e de quitosana nanocristalina foram medidos usando o aparato ZETASIZER NANO ZS90 (Malvern Isntruments).

Resultados e Conclusões finais ou parciais.

Nesta pesquisa foi desenvolvido um novo método de obtenção da quitosana nanocristalina, proveniente do acetato de quitosana. Os resultados de FTIR mostram a mesma estrutura química da quitosana precursora do acetato e da quitosana nanoparticulada, não formam observadas mudanças na estrutura química e tão pouco a formação de produtos secundários provenientes do método de obtenção da quitosana nanocristalina. O estudo da morfologia e EDS mostraram homogeneidade na superfície dos filmes obtidos e traços de silício e sódio, nas amostras de acetato de quitosana e aumento nos traços de sódio na quitosana nanocristalina, devido ao processo de aglomeração da macromolécula (recristalização) de glucosamina. A análise de difração de raios x mostrou os picos de cristalinidade característicos da quitosana precursora, uma diminuição da cristalinidade do acetato de quitosana, devido à dissolução da macromolécula de glucosamina, aumentando seu caráter amorfo. Este efeito foi mais acentuado na quitosana nanocristalina diminuindo o tamanho do cristal, de micro para nano também observado pela análise tamanho de partícula, aumentando assim seu caráter amorfo, hidrofílico e conseqüentemente a reatividade do polímero. A análise de ressonância magnética também ilustra esta mudança estrutural, acrescentando a variação do índice de desacetilação, tanto no acetato de quitosana quanto na quitosana nanocristalina. No acetato de quitosana houve uma redução do índice de desacetilação para 64% comparado com a quitosana de partida 95%, que indica que no processo de dissolução do polímero com ácido acético houve uma diminuição dos grupos aminas livres, que foram reacetilados pela adição do acido acético. Foi possível observar um comportamento parecido na recristalização da macromolécula de glucosamina no método de obtenção da quitosana nanocristalina de 84% porem com um efeito bem menor (processo de aglomeração), mantendo assim o polímero reativo. A adição de hidróxido de sódio promoveu um aumento dos grupos amina livres, formando o acetato de sódio, aumentando assim o índice de desacetilação. O valor do potencial zeta do AQ 2:0,8, em meio ácido (pH 4,43), foi de 43,6 mV. Enquanto o valor da QNC 2:2 (pH 7,3) foi de 15,4 mV. Desta forma, o comportamento da quitosana nanocristalina não se tornou estável devido a alta polidispersividade. A variação do tamanho de partícula das amostras de AQ 2:0,8 e QNC 2:2 utilizando filtros de Mesh 0,450 μm, indicaram o tamanho médio de partícula de 266,0 e 55,52 nm, respectivamente. A quitosana nanocristalina elaborada por este método manteve a mesma estrutura da quitosana precursora conseqüentemente indica ter as mesmas propriedades da quitosana inicial, com um grande aumento do seu caráter hidrofílico e extraordinário comportamento para formação direta de filmes e na criação de uma estrutura nano particulada. Este derivado da quitosana tem um grande potencial para aplicações médicas e farmacêuticas, criando uma geração de biomateriais nano particulados e que favorecem a criação de novos complexos para medicina regenerativa e engenharia de tecidos.

Palavras-chave: Quitosana nanocristalina; Medicina regenerativa; Engenharia de tecidos.