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Este estudo teve como objetivo identificar a adesão, dos profissionais assistenciais de uma Unidade de Terapia Intensiva, quanto aos 5 momentos da higienização das mãos preconizados pela Organização Mundial da Saúde; verificar as situações de fragilidades no programa de higienização das mãos e identificar os momentos de uso de álcool spray. Realizou-se um estudo transversal, analítico, com abordagem quantitativa, embasado em dados secundários obtidos no banco de dados do Controle de Infecção Hospitalar. Foram analisadas 793 observações de maio a dezembro de 2012. Em 446 (56,2 %) das observações não ocorreram a higienização das mãos, sendo que a taxa de adesão ficou em 43,7%. Os fisioterapeutas foram os profissionais de maior adesão à prática nos procedimentos acompanhados (53,5%) e os técnicos de enfermagem tiveram menor adesão (29,2%), com p<0,001. As ações com menor adesão de HM foram aquelas “antes do contato com o paciente” (18,4%) e “antes de procedimento asséptico” (20,9%). Conclui-se que, apesar do conhecimento adquirido ao longo do tempo e a sensibilização pelas campanhas realizadas, a adesão à prática de higienização das mãos pelos profissionais de saúde está distante das necessidades, principalmente frente ao cenário atual com o aumento da prevalência de infecções por microrganismos multirresistentes.